Publicación: Crioconservación de semen bovino usando un congelador programable (CL-8800) y determinación de su calidad postdescongelación por medio un sistema de análisis espermático asistido por computador (CASA)
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Titulo en ingles: Bovine sperm cryopreservation using a programmable freezer (CL-8800) and evaluation of post-thaw sperm quality by a Computer-Assisted Sperm Analysis (CASA).RESUMEN: El objetivo del presente trabajo fue evaluar un protocolo para la congelación de semen bovino, empleando el congelador programable CL-8800 y utilizando un diluyente constituido por Tris (2.42%), acido cítrico (1.8%), fructosa (1.0%), glicerol (7%) y yema de huevo (20%). Toros sexualmente maduros y clínicamente sanos de la raza Sanmartinero fueron usados como donantes de las muestras seminales. El semen fue extraído por electroeyaculación, incubado a 36°C y evaluado macroscópica y microscópicamente. Muestras con movilidad masal superior a 80% fueron mezcladas con el diluyente en dos fracciones, así: fracción A a 36°C (1:1) y fracción B (glicerolada) a 20°C (1:1), esta última incluida en tres alícuotas a intervalos de 15 min. El semen fue empacado en pajillas de 0.5 mL y crioconservado en un congelador programable CL-8800; posteriormente, las pajillas fueron trasladadas a un termo de almacenamiento a -196ºC hasta su evaluación. Para la determinación de la movilidad y velocidad individual, cada pajilla fue descongelada en baño de agua a 36°C por 60 seg y evaluada usando un sistema de análisis espermático asistido por computador (CASA). La movilidad masal y el vigor espermático fueron evaluados en semen fresco no diluido y durante todo el proceso de crioconservación y postdescongelación. La curva de congelación determinada en el congelador CL-8800 ofreció una tasa de congelación total de 4.9°C.min-1 desde 20°C hasta -70°C. En cuanto a la movilidad espermática individual, todas las variables mostraron diferencias significativas (p<0.05) cuando comparadas con semen fresco, a excepción de la movilidad progresiva lineal lenta y movilidad circular.La movilidad masal no varió significativamente durante el proceso de dilución y estabilización (88.0±1.2 y 80.0±1.5%, respectivamente), siendo afectada sólo por la crioconservación (40.0 ± 3.1%). En general, los resultados obtenidos para semen de bovino crioconservado en congelador programable CL-8800 son aceptables para la especie; sin embargo, aún son necesarios ajustes en la tasa de congelación-descongelación.Palabras clave: bovino, CASA, crioconservación, espermatozoide, glicerol, SanmartineroABSTRACT: The aim of the present study was to evaluate a protocol for cryopreservation of bovine semen using a programmable freezer CL-8800, and an extender consisting of tris (2.42%), citric acid (1.8%), fructose (1%), glycerol (7%), and egg yolk (20%). Sexually mature and clinically healthy bulls of the Sanmartinero breed were used as donors of the seminal samples. The semen was obtained by electro-ejaculation, incubated at 36°C, and evaluated macroscopically and microscopically. Samples with mobility higher than 80% were mixed with the extender into two fractions in the following manner: fraction A at 36°C (1:1), and fraction B (with glycerol) at 20°C (1:1). The latter was included in three aliquots in intervals of 15 min. The semen was packaged in straws, each containing 0.5 ml., and cryopreserved in a programmable freezer CL-8800. Then the straws were transferred to a storage reservoir with the temperature held at -196ºC until their contents were evaluated. Each straw was thawed in a water bath at 36° C for 60 seconds, and then sperm mobility and individual sperm velocity were evaluated using a Computer-Assisted Sperm Analysis (CASA). Sperm mobility and spermatic vigor were compared of undiluted fresh sperm, as well as cryopreserved, and post-thawed sperm. The freezing curve obtained with the CL-8800 freezer showed a total freezing rate of 4.9 ºC per minute from 20ºC to -70ºC. The individual sperm mobility showed significant differences (p<0.05) in all variables when compared with fresh sperm. In contrast, differences were not observed in slow lineal progressive mobility and circular mobility. Masal mobility did not vary significantly during the dilution and stabilization process (88.0±1.2 and 80.0±1.5%, respectively) being only affected by the cryopreservation process (40.0 ± 3.1%). In general, the results obtained in the present study for cryopreserved bovine sperm using a CL 8800 programmable freezer are acceptable for this species. However, it is necessary to make adjustments in the freezing-thawing rate.Key words: Bovine, CASA, cryopreservation, glycerol, Sanmartinero, spermatozoa.
Resumen en inglés
Titulo en ingles: Bovine sperm cryopreservation using a programmable freezer (CL-8800) and evaluation of post-thaw sperm quality by a Computer-Assisted Sperm Analysis (CASA).RESUMEN: El objetivo del presente trabajo fue evaluar un protocolo para la congelación de semen bovino, empleando el congelador programable CL-8800 y utilizando un diluyente constituido por Tris (2.42%), acido cítrico (1.8%), fructosa (1.0%), glicerol (7%) y yema de huevo (20%). Toros sexualmente maduros y clínicamente sanos de la raza Sanmartinero fueron usados como donantes de las muestras seminales. El semen fue extraído por electroeyaculación, incubado a 36°C y evaluado macroscópica y microscópicamente. Muestras con movilidad masal superior a 80% fueron mezcladas con el diluyente en dos fracciones, así: fracción A a 36°C (1:1) y fracción B (glicerolada) a 20°C (1:1), esta última incluida en tres alícuotas a intervalos de 15 min. El semen fue empacado en pajillas de 0.5 mL y crioconservado en un congelador programable CL-8800; posteriormente, las pajillas fueron trasladadas a un termo de almacenamiento a -196ºC hasta su evaluación. Para la determinación de la movilidad y velocidad individual, cada pajilla fue descongelada en baño de agua a 36°C por 60 seg y evaluada usando un sistema de análisis espermático asistido por computador (CASA). La movilidad masal y el vigor espermático fueron evaluados en semen fresco no diluido y durante todo el proceso de crioconservación y postdescongelación. La curva de congelación determinada en el congelador CL-8800 ofreció una tasa de congelación total de 4.9°C.min-1 desde 20°C hasta -70°C. En cuanto a la movilidad espermática individual, todas las variables mostraron diferencias significativas (p<0.05) cuando comparadas con semen fresco, a excepción de la movilidad progresiva lineal lenta y movilidad circular.La movilidad masal no varió significativamente durante el proceso de dilución y estabilización (88.0±1.2 y 80.0±1.5%, respectivamente), siendo afectada sólo por la crioconservación (40.0 ± 3.1%). En general, los resultados obtenidos para semen de bovino crioconservado en congelador programable CL-8800 son aceptables para la especie; sin embargo, aún son necesarios ajustes en la tasa de congelación-descongelación.Palabras clave: bovino, CASA, crioconservación, espermatozoide, glicerol, SanmartineroABSTRACT: The aim of the present study was to evaluate a protocol for cryopreservation of bovine semen using a programmable freezer CL-8800, and an extender consisting of tris (2.42%), citric acid (1.8%), fructose (1%), glycerol (7%), and egg yolk (20%). Sexually mature and clinically healthy bulls of the Sanmartinero breed were used as donors of the seminal samples. The semen was obtained by electro-ejaculation, incubated at 36°C, and evaluated macroscopically and microscopically. Samples with mobility higher than 80% were mixed with the extender into two fractions in the following manner: fraction A at 36°C (1:1), and fraction B (with glycerol) at 20°C (1:1). The latter was included in three aliquots in intervals of 15 min. The semen was packaged in straws, each containing 0.5 ml., and cryopreserved in a programmable freezer CL-8800. Then the straws were transferred to a storage reservoir with the temperature held at -196ºC until their contents were evaluated. Each straw was thawed in a water bath at 36° C for 60 seconds, and then sperm mobility and individual sperm velocity were evaluated using a Computer-Assisted Sperm Analysis (CASA). Sperm mobility and spermatic vigor were compared of undiluted fresh sperm, as well as cryopreserved, and post-thawed sperm. The freezing curve obtained with the CL-8800 freezer showed a total freezing rate of 4.9 ºC per minute from 20ºC to -70ºC. The individual sperm mobility showed significant differences (p<0.05) in all variables when compared with fresh sperm. In contrast, differences were not observed in slow lineal progressive mobility and circular mobility. Masal mobility did not vary significantly during the dilution and stabilization process (88.0±1.2 and 80.0±1.5%, respectively) being only affected by the cryopreservation process (40.0 ± 3.1%). In general, the results obtained in the present study for cryopreserved bovine sperm using a CL 8800 programmable freezer are acceptable for this species. However, it is necessary to make adjustments in the freezing-thawing rate.Key words: Bovine, CASA, cryopreservation, glycerol, Sanmartinero, spermatozoa.